ABSTRACT:

Il presente paper delinea le linee guida del College of American Pathologist (Maggio 2020) [1] per la gestione dei campioni tissutali di NSCLC ottenuti con metodiche mini-invasive (approccio endobronchiale/ transbronchiale oppure transtoracico percutaneo) per la caratterizzazione biologica e definizione dei target molecolari per la corretta strategia terapeutica. I campioni ottenuti variano da piccole biopsie come la core needle biopsy (CNB) e le biopsie transbronchiali, nonché campioni citologici da agoaspirato (FNA), apposizioni di biopsia (touch preparation), lavaggi bronchiali (BAL) e liquidi da effusioni pleuriche ottenuti con toracentesi.

INTRODUZIONE

Nel NSCLC in fase avanzata, la diagnosi è spesso posta su campioni istologici o citologici prelevati con tecniche mini-invasive attraverso approccio endo/transbronchiale o transtoracico.

Spesso questo materiale rappresenta l’unico substrato su cui il patologo deve eseguire tutti gli studi di routine necessari per la diagnosi e la determinazione del profilo molecolare del tumore, cui fa seguito una terapia mirata.

Il College of American Pathologist (CAP) ha riconosciuto la necessità di formulare delle linee guida pratiche che dessero raccomandazioni su prelievo, conservazione e processazione dei campioni cito-istologici toracici per consentire adeguate analisi immunoistochimiche, citogenetiche (FISH), citometria a flusso, analisi mutazionali ed indagini microbiologiche.

Le linee guida affrontano campioni speciali come la core needle biopsy (CNB), biopsie transbronchiali, campioni citologici da agoaspirato (FNA), apposizioni di biopsia (touch preparation), lavaggi bronchiali (BAL) e liquidi pleurici ottenuti con toracentesi.

METODI

Un team multidisciplinare di 18 esperti in varie discipline tra cui pneumologia, patologia polmonare, patologia molecolare, citopatologia, microbiologia e radiologia, è stato convocato dal CAP con lo scopo di redigere un vademecum pratico indirizzato agli specialisti dedicati, la cui collaborazione è preziosa ai fini del management del paziente oncologico con NSCLC. È stata condotta una revisione della letteratura che ha preso in considerazione studi di alta qualità, pubblicati e sottoposti a revisione di esperti, con criteri di inclusione stringenti. Una prima ricerca bibliografica completa su PubMed e su Emabase.com  è stata fatta a Marzo 2017 comprendendo un periodo temporale di circa 10 anni (gennaio 2007-Marzo 2017); sono state utilizzate  come parole chiave nomenclature riferite ad affezioni oncologiche toraciche, sono stati inclusi solo studi in lingua inglese ed escluse lettere, commenti, editoriali e case reports. Ulteriori integrazioni sono state eseguite a maggio 2018 e ad aprile 2019.  Dei 4256 studi emersi, solo 218 hanno soddisfatto i criteri di inclusione e sono stati utilizzati come base di evidenza su cui discutere e formulare le nuove direttive.  Dopo 15 web-meeting, scambi di mail e 3 incontri dal vivo, la task force ha redatto un compendio di 16 linee guida da utilizzare per la gestione dei piccoli campioni toracici.

LINEE GUIDA

Sono state redatte 16 linee guida, per ciascuna è indicato:

1. grado di qualità dell’evidenza (come da schema in Figura 1)
2. grado di raccomandazione (come da schema in Figura 2)

Gradi di qualità dell’evidenza

Figura1: Gradi di qualità dell’evidenza.  Adattata da Balshem H et al. [2]

Gradi di forza della raccomandazione

Figura 2: Gradi di forza della raccomandazione. [3]

La seguente scala colorimetrica caratterizza il grado di raccomandazione:

STRONG RECOMMENDATION→ RACCOMANDAZIONE FORTE

RECOMMENDATION→ RACCOMANDAZIONE INTERMEDIA

EXPERT CONSENSUS OPINION → OPINIONE DEGLI ESPERTI

NO RECOMMENDATION→ NESSUNA RACCOMANDAZIONE

Le linee guida sono state suddivise nelle seguenti categorie;

1. A) procedure transbronchiali ecoguidate (EBUS-TBNA),
2. B) procedure transtoraciche,

C)procedure broncoscopiche

1. D) versamenti pleurici
2. E) Indicazioni per esecuzione di studi ancillari per patologia maligna
3. F) Indicazioni per esecuzione di studi ancillari per patologia benigna

1. procedure transbronchiali ecoguidate (EBUS-TBNA)

• Quando ed in quali situazioni

1)  L’agoaspirazione transbronchiale eco guidata può essere utilizzata per una valutazione iniziale di linfonodi ilari e mediastinici, così come di lesioni parenchimali centrali visibili con ecografo transbronchiale. 

 Grado di raccomandazione: FORTE

Grado di qualità dell’evidenza: MODERATO

Commento

Tra i 15 studi che hanno valutato l’utilizzo dell’EBUS-TBNA per il campionamento di lesioni polmonari e /o linfonodali, la maggior parte ne sostengono l’utilizzo in quanto mostra una resa diagnostica elevata con una sensibilità dell’89% ed una specificità del 100%. [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]           

• Calibro dell’ago

2) Quando si esegue una EBUS-TBNA, si possono usare aghi di calibro 19,21 o 22 G.

Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

Solo un numero limitato di studi valuta l’impatto del diametro dell’ago sulla qualità/cellularità del campione ed in questa revisione della letteratura sono stati esaminati gli effetti dell’utilizzo di aghi di calibro 19, 21 e 22 . [11], [12], [13], [14] Non c’è nessuna differenza significativa per la patologia maligna tra l’ago 21 o 22 con il 96.6% di accuratezza contro il 95.3% rispettivamente [13], mentre per le lesioni benigne 88% contro 65% [13], pur trattandosi di campioni adeguati. L’ago 19 sembra fornire prelievi maggiormente ematici, ma comunque idonei ai fini diagnostici e/o studi ancillari [15].

L’evidenza suggerisce che aghi di calibro 22,21 e 19 sono pressoché equivalenti. 

• Valutazione estemporanea dei campioni: ROSE si o no?

3) Quando si esegue un’agoaspirazione transbronchiale ecoguidata, la ROSE dovrebbe essere effettuata, se disponibile.

Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: MODERATO

Commento

L’utilizzo combinato di EBUS-TBNA e ROSE ha alta sensibilità (85.4%-89.5%) [16], [17], [18], [19]. Anche se non ci sono ancora sufficienti evidenze per affermare che la ROSE debba essere richiesta in ogni situazione [11], vi è dimostrazione che possa ridurre il numero di siti biopsiati ed il tasso di complicanze broncoscopiche (6% vs 20% – p=0.01) [20].

4) Per ottenere una resa diagnostica ottimale quando si esegue l’EBUS TBNA senza ROSE, il broncoscopista dovrebbe eseguire un minimo di 3 fino a 5 passaggi se tecnicamente e clinicamente possibile. Quando si esegue la ROSE, il giudizio clinico dovrebbe essere usato per valutare il numero di passaggi necessari. Possono essere richiesti passaggi aggiuntivi per studi ancillari.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: MODERATO

Commento

→ EBUS-TBNA senza la ROSE: sia per patologia maligna che benigna, sono necessari dai 3 ai 5 passaggi per garantire con maggior sicurezza prelievi di materiale diagnostico. [11], [21]

→ EBUS-TBNA + ROSE: non è possibile stabilire numero minimo e massimo di passaggi necessari perché la presenza di un citopatologo qualificato che valuta nell’immediato il prelievo eseguito, può stabilire che il materiale raccolto con meno di 3 prelievi sia quali-quantitativamente adeguato, così come, a fronte di continui prelievi insufficienti, può richiedere che vengano effettuati ulteriori passaggi (anche > di 5) fino a che non si ottengono campioni idonei. [22]

 B) Procedure transtoraciche:

Per esecuzione di FNA (aspirazione con ago sottile), CNB (core needle biopsy, agobiopsia), FNA+CNB.

• Valutazione estemporanea dei campioni: ROSE o apposizione

1.a) Quando si eseguono procedure agobioptiche transtoraciche, la ROSE dovrebbe essere utilizzata per la valutazione dell’adeguatezza, se disponibile e clinicamente possibile.

Grado di raccomandazione: FORTE

Grado di qualità dell’evidenza per utilizzo della ROSE: MODERATO

1.b) Se si esegue una CNB senza eseguire una concomitante FNA, l’apposizione su vetrino della CNB può essere utilizzata per la valutazione dell’adeguatezza, se disponibile.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO.

Grado di qualità dell’evidenza per uso del vetrino di apposizione: BASSO

Commento

ROSE e apposizione su vetrino hanno nettamente migliorato la resa diagnostica [23], [24], [25], [26], [27]. L’ipotesi che la ROSE, comportando un allungamento dei tempi di esecuzione della procedura, potesse incrementare anche il rischio di complicanze (emottisi e pneumotorace), è stato smentito da numerosi studi [11], [28], [23]. Inoltre, nei casi di cancro polmonare, anche le cellule neoplastiche presenti sul vetrino di apposizione possono rappresentare materiale utile per l’esecuzione di test molecolari. [29], [30]

• Calibro dell’ago

2) Quando si eseguono procedure agobioptiche transtoraciche, la misura dell’ago dovrebbe essere decisa dell’operatore ed in relazione al tipo di campione che si desidera ottenere.  Per FNA transtoracici si possono usare aghi piccoli fino ad un calibro di 25 e per le CNB fino ad un calibro di 20.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO.

Grado di qualità dell’evidenza: BASSO

Commento

L’ago viene scelto con lo scopo di ottenere un campione tissutale della maggior dimensione possibile, con il minor rischio di complicanze.

• Cell block

3) Quando si esegue una FNA senza concomitante CNB, dovrebbero essere fatti diversi passaggi, se tecnicamente e clinicamente possibile, inoltre si dovrebbe tentare di raccogliere materiale sufficiente per il citoincluso (cell block, tissue clot).

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

Qualsiasi campione citologico può essere utilizzato per test diagnostici ed ancillari [31], tuttavia fino a che la maggior parte dei laboratori di biologia molecolare non ha convalidato l’esecuzione dei test  su campioni non inclusi in paraffina, il cell block rimane il substrato citologico di prima scelta per lo studio biomolecolare del carcinoma del polmone; è quindi necessario pensare sempre  di prelevare anche  una quota di materiale da indirizzare all’allestimento del citoincluso visto che non sembra esserci associazione tra numero di passaggi e aumento del tasso di pneumotorace [32]. 

• Numero di prelievi

4) Per ottenere una resa diagnostica ottimale durante prelievi transtoracici  di CNB, si dovrebbe tentare di ottenere un minimo di 3 campioni bioptici, se tecnicamente e clinicamente possibile.  Possono essere richiesti campioni ulteriori per gli studi ancillari.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

La decisione sul numero di campioni da ottenere è operatore dipendente e considera alcuni fattori tra cui il rischio di complicanze dovute alla ripetizione del passaggio e il prolungamento dei tempi di sedazione. La revisione della letteratura non ha fornito un volume minimo di tessuto necessario che sarebbe correlato con una quantità adeguata di tumore al fine di eseguire studi ancillari, tuttavia a supporto di questa linea guida uno studio di coorte retrospettivo [33] mostra che l’adeguatezza aumenta significativamente con un numero di prelievi di CNB ≥ 3.

 C) Procedure broncoscopiche:

 Esistono diverse tecnologie broncoscopiche come la broncoscopia TC guidata, broncoscopia virtuale con broncoscopio ultrasottile, broncoscopia a navigazione elettromagnetica (ENB – electromagnetic navigation broncoscopy), che tuttavia non sono disponibili in tutti i centri.

• Tecnologie innovative

1) Se si esegue una broncoscopia per indagare lesioni polmonari periferiche che sono difficili da raggiungere con la broncoscopia tradizionale, possono essere utilizzate delle immagini guida aggiuntive, se si hanno a disposizione competenze ed attrezzature.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

Solo due studi a sostegno di questa linea guida [34], [35]: l’uso combinato broncoscopia-immagini guida, può migliorare la capacità di campionare adeguatamente ed ottenere tessuto anche dai noduli più piccoli.

Pochi e non sufficienti dati su ROSE in queste situazioni.

• Valutazione estemporanea dei campioni: ROSE o apposizione

2.a) Quando si esegue un agoaspirato transbronchiale, la ROSE dovrebbe essere utilizzata per valutarne l’adeguatezza, se disponibile.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza per utilizzo della ROSE: MODERATO

2.b) Se si eseguono biopsie transbronchiali con pinza senza concomitante esecuzione di agoaspirati, può essere fatta l’apposizione su vetrino per valutarne l’adeguatezza, se possibile.

 Grado di raccomandazione: OPINIONE DEGLI ESPERTI

Grado di qualità di evidenza per vetrino di apposizione: MOLTO BASSO

Commento

Anche in questo caso l’utilizzo della ROSE consente di migliorare la resa del campionamento di lesioni polmonari periferiche (con metodica TBNA), consentendo di ridurre il numero di siti biopsiati ed il rischio di eventi avversi, permettendo al broncoscopista di interrompere la procedura non appena si è certi di aver prelevato materiale adeguato e sufficiente [36], [37].

Solo uno studio [27] a supporto dell’utilità dell’apposizione su vetrino, ma gli esperti la ritengono pratica raccomandata da inserire nelle linee guida.

1. D) Versamenti pleurici:

Il versamento pleurico può rappresentare l’unico campione biologico per la diagnosi e la valutazione del profilo molecolare della neoplasia.  Da un campione di liquido pleurico si possono ottenere diversi campioni citologici come striscio diretto, cystospin o citoincluso su cui eseguire colorazioni immunoistochimiche o test di biologia molecolare indispensabili per la gestione del paziente.

• Volume necessario

1) Quando si preleva liquido pleurico per una sospetta diagnosi di neoplasia maligna, si dovrebbe raccogliere un volume di fluido che sia ragionevole sia per la valutazione citologica che per l’esecuzione di studi ancillari. 

 Grado di raccomandazione: OPINIONE DEGLI ESPERTI

Grado di qualità di evidenza: INSUFFICIENTE

Commento

La revisione della letteratura non ha fornito dati specifici e standardizzati per stabilire un valore minimo di volume di liquido pleurico necessario per gli studi ancillari. Numerosi studi [38], [39], [40], infatti, hanno valutato il volume minimo al solo fine identificare cellule maligne, senza considerare la necessità di avere sufficiente materiale anche per colorazioni immunoistochimiche che indirizzino sulla primitività della neoplasia o per  test molecolari che, nel caso di NSCLC, sono necessari ai fini prognostici e terapeutici. Può rendersi necessario comunicare con il laboratorio per sapere quanto liquido pleurico possa servire ai fini di un work-up diagnostico completo.

1. E) Indicazioni per esecuzione di studi ancillari per patologia maligna

• Tipo di campione

1) I campioni citologici (strisci, citoinclusi, Liquid-based citology), possono essere utilizzati per studi ancillari, se supportati da studi validati.

 Grado di raccomandazione: FORTE

Grado di qualità dell’evidenza: BASSO

Commento

Ampia evidenza della possibilità di eseguire immunoistochimica, FISH, NGS, analisi mutazionali per il cancro polmonare su comuni campioni citologici, attraverso metodiche/protocolli redatti in seguito a studi di convalida in quanto la resa di queste metodiche (valore predittivo positivo e negativo) su campioni inclusi in paraffina non è la stessa che su citologico [41], [42], [43].

• Conservazione del campione

2) Campioni agobioptici (CNB) per gli studi ancillari dovrebbero essere fissati in formalina tamponata neutra al 10%.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità dell’evidenza: MOLTO BASSO

Una fissazione tempestiva serve per ridurre l’impatto dell’ischemia fredda sul tessuto così da evitare danni al DNA in fase preanalitica. Il 95% delle agobiopsie poste in formalina sono adeguate per esecuzione di IHC e FISH [44], ma possono esserci artefatti da fissazione perciò è necessario che ogni laboratorio metta a punto protocolli di validazione per evitare errori di interpretazione [45].

Sebbene non ci siano studi che paragonano diversi fissativi, molti kit commerciali che testano fattori prognostici (HER2-PDL1), sono stati validati utilizzando campioni fissati in formalina. Formalina neutra tamponata al 10% è preferita rispetto a quella non tamponata in quanto quest’ultima può talvolta inficiare la buona riuscita dei test molecolari [46].

1. F) Indicazioni per esecuzione di studi ancillari per patologia benigna

Prelievi cito-istologici sono utili anche nell’ambito di malattie infettive: in queste situazioni il primo step prevede generalmente la valutazione dell’espettorato e solo quando non si ottengono informazioni utili si passa a tecniche maggiormente invasive come la broncoscopia.

La revisione della letteratura ha messo in evidenza solo pochi studi inerenti la patologia polmonare non neoplastica che, oltretutto, trattano principalmente di tubercolosi, pertanto le seguenti linee guida fanno riferimento in particolare a questa patologia.

• Ecografia endobronchiale

1) Quando si esegue la broncoscopia per lo studio della tubercolosi, l’ecografia endobronchiale può essere utilizzata per aumentare la resa diagnostica del lavaggio broncoalveolare e della TBB (transbronchial biopsy).

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

L’utilizzo dell’ecografia endobronchiale consente di ottenere campioni bioptici mirati e riduce il tasso di complicanze. Uno studio [47]ha comparato prelevi di 121 pazienti con sospetta TBC effettuati rispettivamente con tecniche di broncoscopia tradizionale ed eco guidata: l’introduzione di EBUS ha migliorato la resta diagnostica passando da 58.3% a 80.8%.

• Numero di campioni

2) Quando si esegue EBUS-TBNA per la valutazione di linfoadenopatia transtoracica granulomatosa con sospetto di TBC, devono essere raccolti campioni per citologia, microbiologia (striscio e cultura) e per eseguire PCR per ricercare la presenza del mycobacterium tubercolosis, se disponibile.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

Tre studi di coorte. [48], [49], [50]

Linfoadenopatia granulomatosa intratoracica isolata pone il sospetto di sarcoidosi, TBC o neoplasia maligna. Non esiste un unico test che da solo consente di fare diagnosi, è necessario combinare più metodi che forniscono informazioni diverse e complementari.

• Microbiologia

3) Durante la raccolta di liquido pleurico per la diagnosi di TBC extrapolmonare,i campioni devono essere inviati per studi culturali di micobatteri utilizzando il protocollo per i campioni liquidi.

 Grado di raccomandazione: INTERMEDIO  

Grado di qualità di evidenza: BASSO

Commento

Esame colturale di micobatteri su supporto liquido permette di avere i risultati batteriologici in tempi minori, ha una sensibilità più elevata e permette di impostare precocemente una terapia così da ridurre il rischio di contagio. [51]

 Non si possono formulare linee guida in merito a

• Miglior/peggiore mezzo di raccolta, fissativo, colorazione per campioni citologici destinati a studi ancillari. Tutti i metodi utilizzati presentavano tassi accettabili di adeguatezza.
• Utilizzo dello stiletto interno durante la fase di aspirazione nell’EBUS-TBNA.
• Tempo ischemico ottimale e tempo di fissazione
• Algoritmo diagnostico per esecuzione dei test

DISCUSSIONE/COMMENTO

Le 16 linee guida proposte si focalizzano su prelievo/conservazione/allestimento di campioni cito-istologici toracici. Viene dato uguale risalto sia al prelievo tissutale che al campione citologico, che spesso rappresenta l’unico substrato disponibile ricco in cellule patologiche. Un tema importante che emerge è la necessità di riuscire ad ottenere con tecniche sempre meno invasive materiale sufficiente ed allo stesso tempo rappresentativo della lesione per permettere l’esecuzione di indagini di laboratorio indispensabili per diagnosi e caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione al NSCLC.  Non vengono presi in considerazione timomi e neoplasie polmonari a cellule fusate; anche la trattazione della patologia infettiva è limitata alla TBC.

Diversi specialisti sono i destinatari di questo documento redatto dal CAP, non solo i patologi.

Al medico interventista vengono fornite indicazioni pratiche che vanno dalla scelta dell’attrezzatura da utilizzare in relazione allo scenario clinico cui si trova di fronte, al calibro dell’ago, fino al numero minimo di passaggi da eseguire prima di dichiarare conclusa la procedura.

La ROSE in molte situazioni assume un significato di rilievo: il citopatologo rappresenta quindi una figura importante in grado di fornire riscontro immediato sulla qualità del campione. La collaborazione clinico-patologo in sede di procedura interventistica permette di ottimizzare la performance con conseguenti vantaggi per il paziente (materiale più adeguato, diagnosi mirata, terapia personalizzata, meno prelievi).

Bibliografia