INTRODUZIONE

I risultati dell’analisi intermedia dello studio KEYNOTE-177 presentati al congresso ASCO 2020 di Chicago potrebbero rappresentare l’inizio di una rivoluzione nell’approccio terapeutico in prima linea dei pazienti affetti da adenocarcinoma del colon-retto metastatico con difetti di funzionamento del complesso del DNA mismatch repair (dMMR) o con presenza di instabilità microsatellitare (MSI). Lo studio ha difatti dimostrato una significativa aumentata risposta clinica alla immunoterapia in prima linea rispetto allo standard of care costituito da chemioterapia ± bevacizumab o cetuximab nei pazienti affetti da neoplasia dMMR/MSI, che rappresentano circa il 4-5% della popolazione metastatica.

I risultati presentati a Chicago rischiano di rivoluzionare anche la pratica diagnostica molecolare in ambito colorettale. Difatti tutti gli adenocarcinomi metastatici dovranno essere profilati per MMR/MSI al momento della diagnosi. Inoltre risulta necessario uno sforzo da parte delle società scientifiche per garantire la standardizzazione e validazione dei test per una caratterizzazione adeguata dello stato di MMR e MSI.

IL DNA MISMATCH REPAIR COMPLEX

Il DNA mismatch repair (MMR) è un complesso proteico altamente conservato da procarioti ad eucarioti e permette di riconoscere e riparare piccole inserzioni, piccole delezioni e discrepanze nel posizionamento di basi che possono insorgere durante la replicazione e la ricombinazione del DNA.

Le proteine MMR più importanti includono MLH1 (mutL homolog 1), MSH2 (mutS homolog 2), MSH6 (mutS homolog 6) e PMS2 (postmeiotic segregation increased 2) (1). Queste quattro proteine hanno la particolarità di funzionare come eterodimeri, in particolare nelle coppie MLH1-PMS2 e MSH2-MSH6 (2, 3). MLH1 e MSH2 sono partner obbligatori di questi eterodimeri, perché possono formare eterodimeri con altre proteine MMR, vale a dire MSH3, MLH3 e PMS1, mentre PMS2 e MSH6 possono solo formare un eterodimero con MLH1 e MSH2 rispettivamente. Questa caratteristica ha implicazioni dal punto di vista di espressione proteica dei geni MMR: in presenza di un’alterazione di MLH1 o MSH2 si ha una successiva degradazione proteolitica della proteina alterata e del suo partner secondario, PMS2 e MSH6, rispettivamente. Al contrario, le alterazioni in PMS2 o MSH6 potrebbero non provocare una degradazione proteolitica dei loro partner primari che possono accoppiarsi con le altre proteine secondarie MMR.

Il malfunzionamento del complesso MMR (i.e. defective MMR, dMMR) può verificarsi a causa di mutazioni germinali e/o somatiche o per silenziamento epigenetico determinato dalla ipermetilazione del promotore a carico dei geni MMR. Tali difetti comportano il conseguente accumulo di mutazioni frame-shift con un conseguente aumento del carico mutazionale (4).

Mutazioni germinali dei geni MMR sono il segno distintivo della sindrome di Lynch e del deficit costituzionale di riparazione del mismatch (CMMRD) (5). La sindrome di Lynch (conosciuta in passato come sindrome del cancro colorettale ereditario non poliposico – HNPCC) è responsabile della maggior parte dei tumori colorettali ereditari ed è stata inserita nel 2017 tra le malattie rare coperte dai Livelli Essenziali di Assistenza (LEA). I pazienti affetti da sindrome di Lynch sono predisposti allo sviluppo di tumori prevalentemente colorettali e dell’endometrio, ma, in misura minore, anche di tumori in altre sedi quali ovaio, stomaco, rene e ureteri, piccolo intestino, cervello, cute, pancreas e vie biliari.

Il silenziamento epigenetico dei geni MMR è solitamente rappresentato dall’ipermetilazione del promotore del gene MLH1. L’ipermetilazione del promotore è descritta anche per il gene MSH6, ma si tratta solitamente di un effetto secondario dopo trattamenti radiochemioterapici (6).

I MICROSATELLITI

I microsatelliti sono sequenze ripetitive di DNA che sono distribuite lungo il genoma delle regioni codificanti e non codificanti e sono particolarmente sensibili agli errori di mancato appaiamento del DNA. I microsatelliti ei loro cugini più lunghi, i minisatelliti, sono classificati come DNA a numero variabile di ripetizioni tandem. Il nome di DNA “satellite” è stato conferito dopo le prime osservazioni che notarono come centrifugando del DNA genomico in una provetta si ha la separazione di uno strato di DNA “massa” da strati “satelliti” di DNA ripetitivo.

Con il termine di instabilità dei microsatelliti (i.e. MSI) si descrive la significativa concentrazione di mutazioni nei microsatelliti che tipicamente consistono in ripetute alterazioni della lunghezza dei loci microsatellitari. Essendo i microsatelliti dei loci proni agli errori determinati da un malfunzionamento del complesso MMR, MSI è una prova indiretta di un dMMR (3). Occorre però notare che il 6-7% dei tumori MSI mantiene l’espressione immunoistochimica delle proteine MMR (7). Alcuni di questi casi “atipici” presentano un’espressione focale per MLH1 o espressione anormale nucleare di tipo dot-like; alcuni casi “atipici” sono da associare ad uno stato ultramutato della lesione neoplastica a mutazioni del gene POLE e successive alterazioni del complesso MMR (7).

CARATTERISTICHE CLINICHE E PATOLOGICHE ASSOCIATE A dMMR/MSI

Lo screening per lo status MMR/test MSI ha diverse importanti implicazioni cliniche: (i) lo screening universale è stato raccomandato nei tumori del colon-retto e dell’endometrio al fine di identificare le famiglie affette da sindrome di Lynch (8); (ii) i tumori dMMR/MSI non beneficiano di terapie adiuvanti a base di 5-fluorouracile (9); (iii) i tumori dMMR/MSI sono risultati idonei per terapie con inibitori del checkpoint immunitario e sono caratterizzati da una sovraespressione di PD-L1 (10-12). In particolare, per quest’ultimo punto bisogna sottolineare come la immunoterapia in questa classe di neoplasie sembra avere un beneficio clinico superiore alle terapie standard of care sia in prima linea (13) che in quelle successive (10, 11).

I pazienti con tumori caratterizzati da dMMR/MSI presentano più spesso una sopravvivenza globale prolungata rispetto ai casi con mantenimento del complesso MMR (i.e. proficient MMR; pMMR) o con stabilità microsatellitare (i.e. MSS) (14). Tuttavia, lo stato dMMR/MSI conferisce un un effetto prognostico negativo nei pazienti trattati con chemioterapia (neo) adiuvante (14).

dMMR/MSI è stato ben descritto in diversi tipi di tumori umani, più frequentemente negli adenocarcinomi colorettali (17% in tutti gli stadi, 4-5% negli stadi IV), endometriali (20%) e gastrici (13%) (15), gli stessi che sono anche i più frequentemente osservati tra i pazienti con sindrome di Lynch.

La maggior parte dei tumori dMMR/MSI sono caratterizzati da una significativa infiltrazione linfocitaria intra e peri-neoplastica ed eterogeneità fenotipica (16). Nell’adenocarcinoma colorettale, lo stato dMMR/MSI è associato all’istotipo mucinoso e ad altri istotipi rari come il carcinoma midollare e l’adenocarcinoma a cellule ad anello con castone (17). Pertanto, la valutazione istopatologia potrebbe aiutare nella identificazione dei casi dMMR/MSI. Tuttavia, va sottolineato il fatto che un piccolo sottoinsieme (~ 6%) di tumori dMMR/MSI non presentano alcuna caratteristica istologica specifica (18), sottolineando la necessità di testare tutte le neoplasie dal punto di vista molecolare.

DIAGNOSI IMMUNOISTOCHIMICA

L’uso della metodica immunoistochimica (IHC) per valutare la presenza o l’assenza di espressione delle proteine MMR MLH1, PMS2, MSH2 e MSH6 è raccomandato in tutti i pazienti con qualsiasi tipo di cancro sporadico appartenente allo spettro dei tumori riscontrati nella sindrome di Lynch (es. colon-retto, endometrio, intestino tenue, urotelio, sistema nervoso centrale e ghiandola sebacea) (19).

Considerato l’elevato tasso di concordanza tra IHC e analisi MSI (20), l’analisi IHC è generalmente preferita. In effetti, IHC ha un tempo di risposta (e quindi refertazione) inferiore, consente di identificare direttamente i geni alterati e richiede una quantità limitata di tessuto (i.e. 4 fettine istologiche di tessuto).

L’espressione delle proteine MMR viene interpreta come (i) mantenuta/positiva, quando nelle cellule tumorali (≥10%) è presente un’espressione da moderata a forte (simile a quanto osservato nelle cellule stromali utilizzate come controllo interno); (ii) perdita, in caso di completa perdita di espressione nucleare nelle cellule tumorali; (iii) indeterminata, se l’intensità di colorazione IHC nelle cellule tumorali è inferiore al controllo interno o il tumore è positivo in <10% (Tabella 1; Figura 1) (21). I risultati IHC indeterminati dovrebbero essere sottoposti a test MSI.

Problemi nella valutazione immunofenotipica della neoplasia sono principalmente causati da una inadeguata fase pre-analitica di fissazione del campione. Spesso questo può essere facilmente riconosciuto dall’assenza di segnale nei controlli interni positivi (i.e. cellule stromali o mucosa colica normale adiacente al tumore) (3). Un altro motivo per ripetere il test o per confermarlo tramite analisi molecolare MSI è il rinvenimento di pattern di positività aberranti come a livello citoplasmatico, colorazione a punti o positività perinucleare. I risultati falsi positivi (cioè pMMR ma MSI) possono essere determinati da proteine MMR mutate cataliticamente inattive, che mantengono la loro integrità antigenica. Inoltre, è stata descritta l’eterogeneità dello stato di MMR/MSI (22); in questi casi, l’analisi deve essere ripetuta su un campione rappresentativo della malattia metastatica.

Nell’adenocarcinoma colorettale (e solo in questo contesto!), i tumori negativi a MLH1/PMS2 devono essere testati per la mutazione BRAF p.V600E poiché questa mutazione è associata e frequentemente osservata nei casi sporadici. Un’altra opzione per identificare un tumore negativo all’eterodimero MLH1/PMS2 come sporadico è la valutazione della metilazione del promotore del gene MLH1.

DIAGNOSI MOLECOLARE

Il test MSI si basa sull’amplificazione PCR dei markers microsatellitari. Sono attualmente in uso due principali pannelli: (i) cinque microsatelliti comprendenti due ripetizioni mononucleotide (BAT-25 e BAT-26) e tre dinucleotide (D5S346, D2S123 e D17S250); (ii) cinque ripetizioni mononucleotidiche poli-A (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24, NR-27). Storicamente, la perdita di stabilità in uno dei cinque marker è stata definita come MSI-bassa (MSI-Low; MSI-L) e perdita di stabilità in ≥2 markers come MSI-alta (MSI-High; MSI-H). Tuttavia, il termine MSI-L dovrebbe essere abbandonato e i tumori MSI-L dovrebbero essere inclusi nei tumori con stabilità dei microsatelliti, con cui condividono le caratteristiche cliniche e di risposta terapeutica (23).

Attualmente il pannello pentaplex basato su cinque ripetizioni di mononucleotidi poli-A è il pannello raccomandato data la sua maggiore sensibilità e specificità (24). Inoltre, questo pannello, avvalendosi esclusivamente di microsatelliti mononucleotidici, può ovviare alla necessità di avere a disposizione del normale tessuto per confronto, che è di fondamentale importanza nell’analisi di piccole biopsie ottenute in pazienti oncologici.

Nel corso degli ultimi anni sono emersi diversi pannelli e metodiche che hanno ricalcato quanto presente nei due principali pannelli e che sono stati positivamente inseriti in ambito diagnostico (22, 25, 26). Tuttavia, mancano degli studi di comparazione dei vari kit in merito alla loro performance di risultato.

Uno studio recente ha dimostrato che quasi il 10% dei pazienti che era stato arruolato in protocolli di immunoterapia per il trattamento di un carcinoma del colon-retto metastatico sia risultato falsamente positivo a dMMR o MSI-PCR (27). L’analisi era stata condotta dai laboratori locali di arruolamento e non confermata dopo centralizzazione del materiale. Questo sottolinea ulteriormente la necessità di standardizzazione delle procedure, identificazione e valutazione dell’impatto degli artefatti preanalitici sul risultato diagnostico e validazione dei kit in uso e dei flussi di lavoro dei laboratori che erogano tale diagnostica. Tali risultati e necessità hanno portato l’ESMO a suggerire la doppia analisi MMR-IHC/MSI-PCR nei pazienti che devono essere valutati per definirne l’idoneità al trattamento con inibitori dei checkpoint immunitari.

Ovviamente, come successo in altri ambiti della diagnostica molecolare, la introduzione delle metodiche di next generation sequencing hanno ampliato le potenzialità diagnostiche nell’ambito dMMR/MSI e la valutazione NGS rappresenta oggi un appropriato test molecolare alternativo nella valutazione dello stato MSI, specialmente nei tumori non associati a sindrome di Lynch (2). Tuttavia, tali metodiche di ultima generazione dovrebbe essere utilizzate solo in centri selezionati con esperienza in queste tecniche.

CONCLUSIONI

La relativa recente introduzione della immunoterapia in ambito oncologico ha rivoluzionato l’approccio terapeutico in molti tumori solidi. Nell’adenocarcinoma del colon-retto una significativa superiorità clinica della immunoterapia è stata dimostrata sia in prima linea che in quelle successive in tumori con difetti di funzionamento del complesso del DNA mismatch repair o con presenza di instabilità microsatellitare. Pertanto, sia MMR-IHC che MSI-PCR si sono dimostrati ottimi marcatori predittivi in questo paradigma oncologico.

Questi risultati hanno portato alla espansione della popolazione tumorale da testare per MMR-IHC e MSI-PCR. In particolare, tutte le lesioni metastatiche devono essere profilate in tal senso.

Nonostante lo studio del complesso MMR e della instabilità microsatellitare siano nozioni storicamente acquisite, mancano ad oggi una adeguata standardizzazione delle procedure diagnostiche e valutazione critica dei kit in commercio. In tal senso, sarà compito delle società scientifiche istituire percorsi di accreditamento dei laboratori in merito a tale diagnostica.

Figura 1. Esempi significativi di risultati alla analisi immunoistochimica delle proteine MMR nel carcinoma colorettale. (A) Espressione mantenuta delle proteine MMR, con positività presente sia nel contesto tumorale che nello stroma peri-tumorale. (B) Perdita totale di espressione di MLH1 in un caso di adenocarcinoma del colonretto. (C) Raro caso di eterogeneità dello stato MMR con una parte di tumore che presenta perdita di espressione proteica. In questi casi si consiglia di andare a valutare lo stato microsatellitare delle due componenti tramite metodica molecolare e, in caso di malattia oncologica avanzata, di andare a ritestare un campione ottenuto da lesione metastatica.

VOCI BIBLIOGRAFICHE

1. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology. 2010;138(6):2073-87 e3. 
2. Luchini C, Bibeau F, Ligtenberg MJL, Singh N, Nottegar A, Bosse T, et al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Ann Oncol. 2019;30(8):1232-43.
3. Remo A, Fassan M, Lanza G. Immunohistochemical evaluation of mismatch repair proteins in colorectal carcinoma: the AIFEG/GIPAD proposal. Pathologica. 2016;108(3):104-9.
4. Galuppini F, Dal Pozzo CA, Deckert J, Loupakis F, Fassan M, Baffa R. Tumor mutation burden: from comprehensive mutational screening to the clinic. Cancer Cell Int. 2019;19:209.
5. Galuppini F, Opocher E, Tabori U, Mammi I, Edwards M, Campbell B, et al. Concomitant IDH wild-type glioblastoma and IDH1-mutant anaplastic astrocytoma in a patient with constitutional mismatch repair deficiency syndrome. Neuropathol Appl Neurobiol. 2018;44(2):233-9.
6. Bao F, Panarelli NC, Rennert H, Sherr DL, Yantiss RK. Neoadjuvant therapy induces loss of MSH6 expression in colorectal carcinoma. Am J Surg Pathol. 2010;34(12):1798-804.
7. Hechtman JF, Rana S, Middha S, Stadler ZK, Latham A, Benayed R, et al. Retained mismatch repair protein expression occurs in approximately 6% of microsatellite instability-high cancers and is associated with missense mutations in mismatch repair genes. Mod Pathol. 2020;33(5):871-9.
8. Hechtman JF, Middha S, Stadler ZK, Zehir A, Berger MF, Vakiani E, et al. Universal screening for microsatellite instability in colorectal cancer in the clinical genomics era: new recommendations, methods, and considerations. Fam Cancer. 2017;16(4):525-9.
9. Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol. 2005;23(3):609-18.
10. Overman MJ, Lonardi S, Wong KYM, Lenz HJ, Gelsomino F, Aglietta M, et al. Durable Clinical Benefit With Nivolumab Plus Ipilimumab in DNA Mismatch Repair-Deficient/Microsatellite Instability-High Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol. 2018;36(8):773-9.
11. Overman MJ, McDermott R, Leach JL, Lonardi S, Lenz HJ, Morse MA, et al. Nivolumab in patients with metastatic DNA mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high colorectal cancer (CheckMate 142): an open-label, multicentre, phase 2 study. Lancet Oncol. 2017;18(9):1182-91.
12. Ribas A, Wolchok JD. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 2018;359(6382):1350-5.
13. Andre T, Shiu K-K, Kim TW, Jensen BV, Jensen LH, Punt CJA, et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for microsatellite instability-high/mismatch repair deficient metastatic colorectal cancer: The phase 3 KEYNOTE-177 Study. Journal of Clinical Oncology. 2020;38(18_suppl):LBA4-LBA.
14. Guinney J, Dienstmann R, Wang X, de Reynies A, Schlicker A, Soneson C, et al. The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nat Med. 2015;21(11):1350-6.
15. Bonneville R, Krook MA, Kautto EA, Miya J, Wing MR, Chen HZ, et al. Landscape of Microsatellite Instability Across 39 Cancer Types. JCO Precis Oncol. 2017;2017.
16. Loupakis F, Depetris I, Biason P, Intini R, Prete AA, Leone F, et al. Prediction of Benefit from Checkpoint Inhibitors in Mismatch Repair Deficient Metastatic Colorectal Cancer: Role of Tumor Infiltrating Lymphocytes. Oncologist. 2020;25(6):481-7.
17. Shia J, Schultz N, Kuk D, Vakiani E, Middha S, Segal NH, et al. Morphological characterization of colorectal cancers in The Cancer Genome Atlas reveals distinct morphology-molecular associations: clinical and biological implications. Mod Pathol. 2017;30(4):599-609.
18. Shia J, Holck S, Depetris G, Greenson JK, Klimstra DS. Lynch syndrome-associated neoplasms: a discussion on histopathology and immunohistochemistry. Fam Cancer. 2013;12(2):241-60.
19. Sepulveda AR, Hamilton SR, Allegra CJ, Grody W, Cushman-Vokoun AM, Funkhouser WK, et al. Molecular Biomarkers for the Evaluation of Colorectal Cancer: Guideline From the American Society for Clinical Pathology, College of American Pathologists, Association for Molecular Pathology, and American Society of Clinical Oncology. Arch Pathol Lab Med. 2017;141(5):625-57.
20. Latham A, Srinivasan P, Kemel Y, Shia J, Bandlamudi C, Mandelker D, et al. Microsatellite Instability Is Associated With the Presence of Lynch Syndrome Pan-Cancer. J Clin Oncol. 2019;37(4):286-95.
21. Sarode VR, Robinson L. Screening for Lynch Syndrome by Immunohistochemistry of Mismatch Repair Proteins: Significance of Indeterminate Result and Correlation With Mutational Studies. Arch Pathol Lab Med. 2019;143(10):1225-33.
22. Loupakis F, Maddalena G, Depetris I, Murgioni S, Bergamo F, Dei Tos AP, et al. Treatment with checkpoint inhibitors in a metastatic colorectal cancer patient with molecular and immunohistochemical heterogeneity in MSI/dMMR status. J Immunother Cancer. 2019;7(1):297.
23. Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, de la Chapelle A, Ruschoff J, et al. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst. 2004;96(4):261-8.
24. Goel A, Nagasaka T, Hamelin R, Boland CR. An optimized pentaplex PCR for detecting DNA mismatch repair-deficient colorectal cancers. PLoS One. 2010;5(2):e9393.
25. Pepe F, Smeraglio R, Vacirca D, Malapelle U, Barberis M, Troncone G. Microsatellite instability evaluation by automated microfluidic electrophoresis: an update. J Clin Pathol. 2017;70(1):90-1.
26. Zwaenepoel K, Holmgaard Duelund J, De Winne K, Maes V, Weyn C, Lambin S, et al. Clinical Performance of the Idylla MSI Test for a Rapid Assessment of the DNA Microsatellite Status in Human Colorectal Cancer. J Mol Diagn. 2020;22(3):386-95.
27. Cohen R, Hain E, Buhard O, Guilloux A, Bardier A, Kaci R, et al. Association of Primary Resistance to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Colorectal Cancer With Misdiagnosis of Microsatellite Instability or Mismatch Repair Deficiency Status. JAMA Oncol. 2019;5(4):551-5.